Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa

Ciclo celular y oncogénesis

Identificación de small RNAs implicados en procesos tumorigénicos mediante análisis funcionales genéticos

Con el descubrimiento, en estos últimos años, de miles de genes que producen pequeños transcritos de RNA no codificantes (small RNAs), se ha puesto de manifiesto que la regulación de la expresión génica es más compleja de lo que se pensaba. Estas moléculas de small RNAs están implicadas en procesos biológicos tan importantes como la diferenciación, apoptosis y proliferación celular, y su expresión anómala está asociada con diferentes patologías como el cáncer.

El hallazgo de que los RNA de interferencia (iRNAs) y micro RNAs (miRNAs) pueden utilizarse para suprimir la expresión génica, ha conducido al descubrimiento de nuevos genes implicados en diferentes procesos biológicos mediante análisis por pérdida de función. Uno de nuestros objetivos principales es el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la identificación de moléculas de small RNAs implicadas en tumorigénesis. Una estrategia es la generación de nuevas genotecas de iRNAs que cubran transcriptomas completos. Estas genotecas se generan a partir de oligonucleótidos de 19 bases, de secuencia aleatoria, flanqueados por secuencias constantes y enriquecidos específicamente mediante hibridación con moléculas unicatenarias de cDNAs provenientes de transcriptomas específicos. Tras la retrotranscripción y amplificación, los duplex generados se clonan en vectores lentivirales entre los promotores H1 y U6. Tras la integración de los lentivirus en el genoma celular, se generan moléculas de RNA de doble cadena correspondientes a los oligonucleótidos clonados, activándose el complejo multiproteico RISC, que recluta y dirige una de las cadenas del dúplex RNA hasta la molécula diana de mRNA complementaria, promoviendo su degradación. Mientras que cada molécula iRNA reconoce como diana únicamente su mRNA complementario, cada molécula de miRNA puede bloquear hasta cientos de mRNAs distintos; este hecho posibilita la búsqueda de fenotipos poligénicos. Actualmente las genotecas de miRNAs se han utilizado para identificar miRNAs y analizar el patrón de expresión de éstos; sin embargo, no permiten ensayos funcionales masivos. Nuestra siguiente estrategia es el desarrollo de análisis funcionales utilizando genotecas lentivirales de miRNAs, siguiendo métodos estandarizados de clonación de miRNAs. Lo novedoso de nuestra tecnología radica en que los small RNAs pueden ser expresados en su versión madura manteniendo su funcionalidad (Patentes P200703258, EPO9382003). Este hecho, extrapolable a cualquier small RNA, permite clonar y expresar directamente cualquier small RNA presente en la célula. Estas genotecas se están utilizando para llevar a cabo escrutinios masivos de pérdida de función en células de mamífero e identificar genes implicados en la señalización del checkpoint del huso mitótico, en la muerte celular por pérdida de interacción con la matriz celular (anoikis) y en metástasis.

Función del gen pttg1/securina en tumorigenesis

El gen Ptt1/securina se sobreexpresa frecuentemente en tumores de diferentes etiologías y su expresión esta estrechamente asociada con la agresividad del tumor. Nuestro grupo investiga diferentes mecanismos no excluyentes que puedan participar en la función tumorigénica de PTTG1. Esta proteína inhibe la separación de cromátidas hermanas en vertebrados, y puede por tanto mediar la segregación anómala de los cromosomas pudiendo dar lugar a un aumento del número de copias de protooncogenes o a una disminución del número de copias de supresores tumorales. PTTG1 se une a Ku, la subunidad reguladora de la quinasa dependiente de DNA (DNA-PK). Esta asociación se rompe cuando aparecen roturas de doble cadena en el DNA, indicando que PTTG1 podría conectar la respuesta celular al daño en el DNA con la separación de cromátidas. Además, PTTG1 interacciona con p53 inhibiendo su actividad transcripcional, sugiriendo que el efecto tumorigénico de la sobreexpresión de PTTG1 podría resultar de la modulación de las funciones de p53. Finalmente, nuestro grupo ha propuesto que PTTG1 actúa como un regulador de la actividad transcripcional, participando en la regulación de la expresión de genes implicados en diferentes procesos celulares. Actualmente estamos identificando genes diana de PTTG1 y estudiando los mecanismos en los que estos genes participan. Hemos centrado nuestra atención en los genes diana que codifican las quimioquinas CXCL12 y CCL2. Las células que sobreexpresan estas quimioquinas atraen linfocitos, monocitos y macrófagos. Estas células hematopoyéticas son factorías productoras de proteasas, factores de crecimiento y factores angiogénicos y linfogénicos. Esta respuesta génica estaría estrechamente relacionada con la función tumorigénica de PTTG1, aportando ventajas de crecimiento al tumor primario y facilitando la formación de metástasis. Además, podemos anticipar que PTTG1 tiene una función importante en la diferenciación de los preadipocitos, mediante la inducción del gen dlk-1, un potente inhibidor del proceso de diferenciación. Herramientas importantes para estos estudios son los ratones carentes del gen pttg1, y los ratones biransgénicos, generados en nuestro laboratorio, que expresan específicamente el gen pttg1 en las glándulas mamarias y salivares, bajo un promotor inducible por doxiciclina.

Patentes:

Inventores (p.o. de firma): José A. Pintor-Toro, Miguel Angel Moreno Mateos, Iván Valle Rosado
Título: “Methods and kits to generate transcriptoma-specific siRNAs libraries by convergent transcription”
N. de solicitud: P200703258
País de Prioridad: Es
Países a los que se ha extendido: AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, BR, HR, HU, IE, IS, IT, LI, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO,SE, SI, SK, TR
Empresas que la están explotando: NewBiotechnic SA. CSIC.
Inventores (p.o. de firma): José A. Pintor-Toro, Miguel Angel Moreno Mateos
Título: “Methods and kits to generate miRNA and small RNA-exressing verctors, and its application to develop lentiviral exressions libraries”
N. de solicitud: 09382003.3-1212
País de Prioridad: Es
Países a los que se ha extendido: AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, BR, HR, HU, IE, IS, IT, LI, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO,SE, SI, SK, TR
Empresas que la están explotando: NewBiotechnic SA. CSIC.

Proyectos activos:

P09-CVI-5111
SAF2011-22486
BIO-186

Artículos:

A Dominguez, F.Ramos-Morales, F.Romero, R.R.Ríos, F.Dreyfus, M.Tortolero and J.A.Pintor-Toro “hpttg, a human homologue of rat pttg, is overexpressed in hematopoietic neoplasms.Evidence for a transcriptional activation function of hPTTG” Oncogene 17, 2187-2194 (1998)

Carmen Sáez, Miguel A Japón, Francisco Ramos-Morales, Francisco Romero, Dolores I Segura, María Tortolero and José A Pintor-Toro “hpttg is over-expressed in pituitary adenomas and other primary epithelial neoplasias” Oncogene 18, 5473-5477 (1999)

F. Ramos-Morales, Á. Domínguez, F. Romero, M.C. Multon, J. A. Pintor Toro and M. Tortolero “Cell cycle regulated expression and phosphorylation of hpttg proto-oncogene product” Oncogene 19, 403-409 (2000)

Francisco Romero, Marie-Christine Multon, Francisco Ramos-Morales, África Domínguez, Juan A. Bernal, José A. Pintor-Toro and María Tortolero “Human securin/hPTTG is associated with the DNA-dependent protein kinase” Nucleic Acid Res. 29, 1300-1307 (2001)

Juan A. Bernal, Rosa Luna, Águeda Espina, Francisco Ramos-Morales, Francisco Romero, Carmen Arias, Icíar Lázaro, Augusto Silva, María Tortolero and José A. Pintor-Toro “Human securin hPTTG interacts with p53 and modulates p53-mediated transcriptional activity and apoptosis” NATURE Genetics 32, 306-311 (2002)

Carmen Sáez, Teresa Pereda, Agueda Espina, Francisco Romero, Dolores I Segura, María Tortolero, José A. Pintor-Toro and Miguel A. Japón. Expression of hpttg proto-oncogene in lymphoid neoplasms Oncogene 21, 8173-8177 (2002)

Francisco Romero, Ana M. Gil-Bernabé, Carmen Sáez, Miguel A. Japón, José A. Pintor-Toro and María Tortolero “Securin is a target of the ultraviolet-response pathway in mammalian cells” Mol Cell Biol.24, 2720-2733 (2004)

Saez C, Martinez-Brocca MA, Castilla C, Soto A, Navarro E, Tortolero M, Pintor-Toro JA, Japon MA. “Prognostic Significance of hPTTG Immunohistochemical Expression in Differentiated Thyroid Cancer”. J Clin Endocrinol Metab. 2006 Apr;91(4):1404-9

Juan A. Bernal, Marta Roche, Cristina Méndez-Vidal, Agueda Espina, María Tortolero and José A. Pintor-Toro “Proliferative potential after DNA damage and non-homologous end joining are affected by loss of securin” Cell Death and Differentiation. 2008 Jan;15(1):202-12

Agustín Hernández, Guillermo López-Lluch, Juan A Bernal, Plácido Navas and José A. Pintor-Toro “Dicoumarol downregulates human PTTG1/Securin mRNA expression through inhibition of Hsp90”. Molecular Cancer Therapeutics 7(3):474-482 (2008)

M.Cristina Limón-Mortés, M.Mar Mora, Agueda Espaina, José A. Pintor-Toro, Antonio López-Román, Maria Tortolero and Francisco Romero “UV-induced degradation of securin is mediated by SKP1/CUL1/bTrCP E3 ubiquitin ligase” Journal of Cell Science 121: 1825-1831(2008)

Agustín Hernández, Guillermo López-Lluch, Plácido Navas and José A. Pintor-Toro HDAC and Hsp90 inhibitors down-regulate PTTG1/Securin but do not induce aneuplody Genes, Chromosomes and Cancer 48(2):194-201 (2009)

Águeda G. Espina, Cristina Méndez-Vidal, Miguel A. Moreno-Mateos, Carmen Sáez, Ana Romero-Franco, Miguel A. Japón and José A. Pintor-Toro “Induction of Dlk1 by Pttg1 inhibits adipocyte differentiation and correlates with malignant transformation” Mol Biol Cell 20: 3353-3362 (2009)

Jefe de grupo:
  • José Antonio Pintor Toro
Investigadores Predoctorales:
  • Salvador Polo Generelo
Técnicos:
  • Belén Torres Agrela