Cabimer - Terapia celular en neuropatologías
 



Terapia celular en neuropatologías

Inicio departamentos Terapia Celular y Medicina Regenerativa Terapia celular en neuropatologías

 
Jefe de grupo:
Investigadores Postdoctorales:
Becarios Predoctorales:

 

Introducción

Nuestro laboratorio tiene como objetivo el estudio de diversas células madre (CM), tanto adultas como fetales, para su posible aplicación en Medicina Regenerativa. Estudiamos los mecanismos que emplean dichas CM para regenerar tejido dañado y desarrollamos estrategias de trasplante que puedan ser útiles en el tratamiento de distintas neuropatologías, como la ataxia, el ictus o la epilepsia.
La Ataxia es una enfermedad denominada rara al afectar a un reducido número de personas, pero no por ello menos importante. Los enfermos se caracterizan por su incapacidad de coordinar movimientos debido a una degeneración progresiva del cerebelo. Conlleva pérdida de la locomoción, habla y a largo plazo problemas cardiacos y la muerte. Estamos desarrollando un tratamiento mediante trasplante de CM adultas derivadas de la MO que, a través de un mecanismo de fusión celular de reciente descubrimiento, podría revertir las mutaciones que causan algunos tipos de ataxia.
Por contra, el accidente cerebro-vascular o Ictus es una de las enfermedades más frecuentes en las sociedades modernas. En los últimos años, se ha empezado a usar células de la MO en el tratamiento de modelos animales con Ictus. Varios grupos han observado una mejora en los síntomas post-isquémicos, que se ha asociado a la aparición de nuevos vasos en la zona de penumbra y la secreción por parte de las células de MO de una serie de factores tróficos, pro- neurogénicos y anti-apoptóticos. En el laboratorio estudiamos el mecanismo por el que se forman los nuevos vasos y comprobamos si las CM derivadas de la MO pueden ser utilizadas como vectores para el transporte de fármacos paliativos.
La tercera patología que nos interesa es la Epilepsia, que afecta al 1% de la población y supone un trastorno crónico que impide el normal desarrollo cerebral y psíquico del individuo, dificultando enormemente su plena integración sociolaboral. Afecta a sectores muy jóvenes, tiene tratamientos muy costosos y una gran carga familiar. Actualmente, existen tratamientos farmacológicos con una eficacia aceptable, pero sólo palian los síntomas y en muchos casos se desarrollan farmacoresistencias, por lo que se muestran inútiles. La terapia celular, mediante el uso de precursores neuronales fetales, podría curar definitivamente las crisis epilépticas y supone una alternativa terapéutica para los pacientes fármaco-resistentes.

Líneas de Investigación

-Fusión Celular como Mecanismo Neuroregenerativo
-Terapia Celular para la Ataxia Mediante Células Madre Adultas de MO
-Papel de la Fusión Celular en la Regeneración del Ictus
-Trasplante de Precursores Neuronales de la MGE para el Tratamiento de la Epilepsia

Fusión Celular como Mecanismo Neuroregenerativo

En los últimos años se ha comprobado que células derivadas de la MO poseen una plasticidad o potencial de formar tipos celulares, incluidos neuronas, diferentes a los habituales linajes hematopoyético o mesenquimal. Uno de los mecanismos que emplean para lograr esta plasticidad es la fusión celular. Nuestro grupo descubrió hace unos años que algunas células derivadas de la MO son capaces de fusionarse con células del hígado, corazón y neuronas. Ello abrió nuevas expectativas en genética y terapia celular, ya que las células de la MO, al fusionarse, aportan material genético nuevo que podría corregir un defecto genético, o rescatar una célula en degeneración. De hecho, en el caso del hígado, ya se ha demostrado que transplantes de médula ósea permiten, mediante el proceso de fusión celular, la curación de ratones que padecían una tirosinemia aguda hepática de consecuencias letales. En nuestro laboratorio estamos interesados en aplicar este mecanismo de fusión en el tratamiento de patologías del sistema nervioso, ya que también se fusionan las neuronas. En los siguientes apartados damos detalles de las líneas de trabajo. Por otra parte, también deseamos estudiar en mayor profundidad los mecanismos que controlan y promueven la fusión celular. Uno de los handicaps del proceso de fusión es su baja frecuencia, por ello, si logramos descubrir los factores que controlan la fusión podremos inducirla de forma que alcance los niveles terapéuticos deseados.

 

 

Sistema de detección de la fusión celular. a) Representación esquemática del transgén expresado por una de las líneas de ratones que se usa en el sistema. b) Representación del transgén reportero del ratón R26R y su posterior modificación tras sufrir la recombinación mediada por la enzima Cre recombinasa. c) Esquema de la fusión celular y su detección con X-gal. Cuando una célula que expresa la Cre recombinasa (procedente del animal en a) fusiona con una célula procedente del animal R26R (b), el codón de parada flanqueado por secuencias lox es eliminado, lo que permite la expresión del gen reportero LacZ en la célula fusionada. La expresión de LacZ puede ser detectada fácilmente mediante una reacción con X-Gal que produce un precipitado azulado. d) Esquema de la estrategia de trasplantes de MO que se realizan para detectar la fusion celular in vivo. Un animal R26R se usa como receptor de ce células de MO procedentes de un animal que expresa la Cre recombinasa y, además, la proteina verde fluorescente (GFP). La doble detección de GFP y de la tinción de X-Gal permite discernir entre los posibles eventos de fusión celular y de transdiferenciación.

 

Terapia Celular para la Ataxia Mediante Células Madre Adultas de MO


Como hemos mencionado, uno de los tipos celulares que se fusiona con las células de la MO son las neuronas de Purkinje. Precisamente, varios tipos de Ataxias son causadas por mutaciones génicas recesivas que provocan la degeneración de estas neuronas. La fusión celular podría revertir este tipo de mutaciones y, por tanto, revertir el proceso degenerativo. Para comprobarlo, disponemos de un modelo animal de Ataxia gracias a la colaboración con el grupo del Dr. J.R. Alonso de la U. de Salamanca. En este modelo estamos realizando trasplantes de MO. Hasta la fecha, los trasplantes alargan el tiempo de supervivencia de estos ratones atáxicos y logran una mejoría parcial de su sintomatología motora, evaluada mediante footprinting, campo abierto y rotorod. Actualmente, estamos estudiando a nivel histológico el cerebelo y la musculatura de los animales trasplantados en donde hemos encontrado la presencia de células derivadas del trasplante.



Fusión Celular en el cerebro (A): Deteción mediante tinción de X-Gal de neuronas de Purkinje in el cerebelo. El análisis de su soma reveló la presencia de 2 núcleos (B), uno de ellos con la morfología clásica de las neuronas de Purkinje (cabeza de flecha) y un segundo núcleo completamente redondeado y liso (flecha), origen hematopoyético. (C): Microfotografía electrónica mostrando la presencia de los 2 núcleos.

Papel de la Fusión Celular en la Regeneración del Ictus

Observaciones previas del grupo indicaban la presencia de células fusionadas en la vasculatura cerebral. Ello sugería que la fusión celular jugaba un papel en los procesos angiogénicos post-isquémicos. Para estudiar en detalle este proceso, realizamos una serie de trasplantes de MO usando el sistema cre/lox de detección de fusión celular. Posteriormente, inducimos una isquemia cerebral focal y pasamos a cuantificar los eventos de fusión celular mediante tinciones de X-Gal a diferentes tiempos tras el accidente cerebro-vascular. Una semana después del ictus observamos un fuerte incremento en el número de eventos de fusión celular en zonas periféricas al daño causado por la isquemia. Las células positivas para X-Gal, es decir fusionadas, se encontraban asociadas a vasos sanguíneos lo que sugería que podían ser endotelio, pericítos o macrófagos perivasculares. Análisis detallados mediante inmunohistoquímica con marcadores específicos de tipo celular y por microscopía electrónica, en colaboración con el Dr. García –Verdugo de la Universidad de Valencia, han confirmado que las células fusionadas se tratan de pericitos, células muy importantes en la formación de nuevos vasos.

Trasplante de Precursores Neuronales de la MGE para el Tratamiento de la Epilepsia


La Eminencia Ganglionar Media (MGE) es la principal fuente de interneuronas GABAérgicas de la corteza cerebral y el hipocampo. Recientemente, hemos demostrado que el trasplante de estos precursores neuronales permite modificar de forma local y específica la actividad inhibitoria cortical. Ello les hace ideales para su uso en terapia celular contra la epilepsia, ya que podrían corregir las alteraciones del sistema GABAérgico, una de sus principales causas. En el último año hemos puesto a punto los modelos animales de epilepsia de Kainato y Pilocarpina, en colaboración con el Dr. L.E. de Mello de la UNIFESP de Brasil. Además, hemos puesto a punto un modelo más novedoso mediante ablación específica de interneuronas positivas para el receptor de substancia-P, administrando intracraneal un neurotóxico, la saporina, conjugado a la substancia-P. Esto provoca la eliminación controlada de interneuronas que conllevan una reducción de la actividad inhibitoria en la zona de ablación. En estos modelos animales estamos realizando trasplantes de precursores de la MGE para demostrar su potencial terapéutico. La evaluación de la recuperación de la actividad inhibitoria en los animales tras el trasplante, mediante análisis de electrofisiológica, nos está deparando resultados muy esperanzadores.



Trasplante de progenitores neuronales. (A-C): Detección de precursores derivados de la MGE, 30 días después de su trasplante en el cerebro de ratones neonatos. Las células trasplantadas GFP positivas co-localizan para GABA, el principal neurotransmisor inhibitorio. (D): Ejemplo de la amplia distribución que se consigue tras el implante de estos precursores en zonas del cortex y el estriado. Cada pequeño punto negro es una célula procedente del trasplante.


Financiación

Colectivo Ataxias en Movimiento. Nuestro más sincero agradecimiento a esta asociación de enfermos de ataxia que son ejemplo de lucha y superación permanente (http://www.ataxiaenmovimiento.org).
Fundación Alicia Koplowitz
Ministerio de Innovación, Ciencia y Tecnología
Ministerio de Sanidad (Instituto de Salud Carlos III)

Postdoctorales y doctorandos financiados por:

Institutito de Salud Carlos III
Fundação para a Ciência ea Tecnologia de Portugal


Publicaciones

Revisiones

Alvarez-Dolado M (2007) “Cell Fusion: biological perspectives and potential for regenerative medicine” Front. Biosci 12(1): 1-12

Jones-Davis D, Calcagnotto ME & Sebe JY (2009) “Interneuron Loss as a Cause of Seizures: Lessons from Interneuron-Deficient Mice” Animal Models of Epilepsy: Methods and Innovations, Vol. 40, Cap 8, ISBN: 978-1-60327-262-9

Artículos Recientes

Wichterle H, Alvarez-Dolado M, Erskin L, Mason C & Alvarez-Buylla A. (2003) “Directional guidance of tangentially migrating neurons to the developing neocortex” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2): 727-32

Alvarez-Dolado M, Pardal R, Garcia-Verdugo JM, Fike JR, Lee HO, Pfeffer K, Lois C, Morrison SJ & Alvarez-Buylla A. (2003) “Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes.” Nature. 425(6961):968-73

Cobos i, Calcagnotto ME, Vilaythong AJ, Noebels JL, Baraban SC & Rubenstein JL (2005) “Mice lacking Dlx1 transcription factor exhibit subtype-specific loss of interneurons, reduced inhibition and epilepsy Nat. Neurosci. 8(8):1059-68

Calcagnotto ME, Paredes MF, Tihan T, Barbaro MN & Baraban SC. (2005) ”Dysfunction of synaptic inhibition in epilepsy associated with focal cortical dysplasia” J Neurosci. 25(42): 9649-57

Alvarez-Dolado M, Calcagnotto ME, Karkar KM, Southwell DG, Jones-Davis DM, Estrada RC, Rubenstein JLR, Alvarez-Buylla A & Baraban SC (2006) “Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain” J. Neurosci. 26(28): 7380-89

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Long JE, Garel S, Alvarez-Dolado M, Yoshikawa K, Osumi N, Alvarez-Buylla A & Rubenstein JL. (2007) “Dlx-dependent and -independent regulation of olfactory bulb interneuron differentiation.” J Neurosci. 27(12):3230-43

Piquer-Gil, M, García-Verdugo, JM, Zipancic, I, Sánchez, MJ & Alvarez-Dolado M (2009) ”Cell fusion contributes to pericyte formation after stroke” J Cereb. Blood Flow & Met. 29(3):480-5.

Current projects:


         SAF2009-07746
         253917 STROKECELLFUSION
         PI-0736/2010
         PTE REFERENCIA CSIC